1. 试剂盒使用前室温平衡20-30分钟

　　温度是ELISA结合反应的重要影响因素，为使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有的试剂平衡至室温，包括检测样本，避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。若无该过程，可能导致一些弱阳性样本出现假阴性。

　　2. 规范加样：不规范的移液操作可能带来0.1%到5%的移液误差，甚至更高！

　　a. 移液器定期校准：选择密封性好质量可靠的吸头，吸量不准确，直接影响检测结果；

　　b. 加样前，溶液充分混匀，垂直悬空加入液体，避免加在孔壁上，不可产生气泡；

　　c. 加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录；

　　d. 如果加样枪漏气以至于加样的量不够，不能用枪吸出再加，做相应记录实验；

　　e. 每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。

　　3. 标准品的溶解与稀释，严格按说明书要求进行。

　　a. 粉末标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。

　　b. 根据瓶标签加入一定体积的蒸馏水(或说明书溶液），加水后轻柔涡旋震荡，室温静置溶解10-30分钟，让粉末*溶解。

　　注意：加水(或说明书溶液）后暂不用移液枪吹吸，避免蛋白未溶解，枪头带出部分蛋白，待*溶解后可吹吸或涡旋振荡混匀。

　　4. 标准品和样本做复孔

　　复孔的目的在于：可以计算检测结果平均值，使实验结果更准确；通过复孔结果对比，评估试剂盒的精密度及实验中是否存在误操作；

　　5. 震荡操作

　　a. 孵育过程震荡，可以加快、加强抗原抗体之间的相互碰撞接触，使得反应更加*，OD值通常比未震荡孵育的结果要高；

　　b. 洗涤过程中震荡，可以使洗板更干净，很大程度上降低背景值，同时提高试剂盒检测的灵敏度。

　　6. 试剂盒洗涤操作

　　a. 手工洗板，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；

　　b. 机器洗板应经常检查冲洗头是否畅通，若被杂物堵塞可用注射器针头挑出。

　　c. 扣干后的酶标板应立即加液，不能干板太久。

　　7. 显色判断

　　说明书中提供的显色时间仅为经验，具体时间需随时注意观察。通常高浓度的标准品颜色不再变深，S1、S2、S3有明显梯度，S5有淡蓝色，或者标准品S1孔在630 nm的OD值在0.5-0.7、S5孔的OD值达到0.05-0.08，可以终止反应。

　　8. 检测

　　a. 酶标仪使用前务必预热10-15分钟，使结果更稳定；

　　b. 采用双波长测定吸光值，排除单波长检测时的测定干扰（样本的干扰、干扰色等）。试剂盒一般采用大波长为参考波长，在参考波长630 nm(570 nm)下，检测物的吸光值小，检测波长450 nm和参考波长630 nm(570 nm)的吸光值之差可以消除非特异性吸收，双波长测定，可以大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。