预期用途

此酶免试剂盒用于细胞裂解液，组织，血浆和尿液中cGMP的定量检测

 

实验原理

此试剂盒采用的竞争酶免法，游离的cGMP和乙酰胆碱酯酶标记的cGMP共同竞争结合位点上一定量的cGMP特异性兔抗。由于标记的cGMP量不变，随着游离的cGMP的不同，标记cGMP与兔抗结合，结合的量与孔内游离的cGMP浓度成反比。兔抗-cGMP复合物再与预先包被在微孔板内的鼠单抗抗兔IgG结合，洗板洗去未结合的复合物，然后加入底物显色液，反应液有明显的黄色并在412nm处有强吸光度值，显色强度与结合的标记cGMP浓度成正比，而与游离的cGMP成反比。

 

试剂盒组成

 

实验所需材料但试剂盒未提供

1.      酶标仪 405-420nm

2.      可调节的移液管和可重复使用的吸量器

3.      超纯水

4.      用于样品准备的其它器材

 

储存条件和稳定性

此试剂盒需按要求储存于-20℃,并在有效期内使用,有效期见盒外

 

实验前准备

缓冲液制备

所有缓冲液贮存在4℃至2个月

EIA缓冲液准备

将1支EIA缓冲液（编号:400060）加90 ml超纯水进行稀释.确保冲洗掉瓶内盐类沉淀物.

洗涤液准备

用2L的超纯水稀释5 ml400倍浓缩的洗涤液（96T试剂盒,编号:400062）,同时加入1 ml吐温20（编号:400035） 或者 用5L的超纯水稀释12.5 ml400倍浓缩的洗涤液（400T试剂盒,编号:400062）, 同时加入2.5 ml吐温20（编号:400035）

提示:由于吐温20是粘性液体,所以不能用常规的移液管移液.需用位移移液管与注射器进行定量.

 

样品准备

一般情况下，尿液和组织上清液可用缓冲液稀释，然后直接加入微孔内。血浆，血清，全血和组织匀浆和其他非均匀的基质可能会含有感染实验的杂质，在进行大量样品检测时是先进行干扰检查。进行干扰检测试验时，稀释1到2个检测样品，每个样品两个不同的稀释比例，如果在zui后的cGMP浓度计算中两个不同稀释比例的样品具有良好的相关性，则不需纯化，否则需进行纯化。由于多数样品中都会含有磷酸二酯酶，样品纯化强制酶对cGMP的水解。

 

血浆（血清）纯化

500ul的血浆加上2ml的冰乙醇混匀，室温下放置5min，1500xg下离心10min以除去沉淀，将上清移至另一10ml的干净试验管。在真空离心机中或者氮气气流中干燥上清液，然后再加入500μl的EIA缓冲液溶（离心机能用来干燥提取物中的水分），确保所乙醇已经除尽以免微量的乙醇影响检测结果。

 

培养基样品

组织和细胞上清无需纯化可直接用于试验。如果样品中的cGMP浓度足够高则需用缓冲液进行10倍的稀释，试验操作无需进行任何改动。当样品低浓度时（样品无需缓冲液稀释），稀释同一培养基中的标准曲线，以达到样品和标准品基质达到相符合。我们建议要首先建立标准曲线以确保在特殊的样品中试验也可进行。

细胞液抽提

1.    提出培养基

2.    每35cm²表面区域加入1ml的0.1M的盐酸

3.    室温下孵育20min

4.    用刮刀将细胞从表面刮落

5.    用移液枪吹打混匀直至上清均匀，转移至合适的离心管内

6.    1000xg

这些上清可直接用于试验

 

组织样品

7.    组织中的循环核苷酸会立即分解，所以下离心10min

1.    上清倒入另一干净试验管内采样后应将其立即冰冻

2.    冰冻组织称量，滴加5-10个单位（液体/ml，组织/g）的TCA,用匀浆器将样品混匀。

3.    1500xg下离心10min，去除沉淀，将上清移至另一干净试验管

4.    用水-饱和乙醚从样品中抽提TCA。5体积的乙醚和1体积的上清，混合10秒，萃取分离，去除上层，重复抽提两次以上。

5.    通过在70℃下加热样品以除去剩余的乙醚。

组织中提取的上清无需稀释可直接用于试验，标准曲线基质液的准备，抽提10ml 用乙醚处理过的5%的TCA，通过加热除去剩余的乙醚，剩下的溶液检测得标准曲线。

 

特异性试剂的制备

cGMP  AChE示踪液

100dtn cGMP  AChE示踪液与6ml的缓冲液

或500 dtn cGMP  AChE示踪液与30ml的缓冲液

配制的cGMP示踪液应储存在4℃下，4周内有效

示踪染料：加入染料可辅助目测观察，在配制好的示踪液中加入染料（60ul的染料加入到6ml的示踪液中或是300ul染料和30ml的示踪液）

cGMP抗血清

100dtn cGMP抗血清与6ml的缓冲液

或500 dtn cGMP抗血清与30ml的缓冲液

配制的cGMP抗血清应储存在4℃下，4周内有效

抗血清染料：加入染料可辅助目测观察，在配制好的抗血清中加入染料（60ul的染料加入到6ml的抗血清中或是300ul染料和30ml的抗血清）

无乙酰化的标准品和样品的准备

1ml的缓冲液配制cGMP标准品，终浓度为300 pmol/ml，贮存在4℃下，可保存6周。

标准品准备：准备8个干净试管，标号，吸取900ul缓冲液至1号管，2-8号管加500ul缓冲液，吸取100ul bulk标准品（300 pmol/ml）至1号管，混匀，从1号管吸取500ul至2号管，混匀，依次进行稀释。稀释的标准品贮存时间不能超过24h

如图

样品的准备：如果样品需要纯化，则根据纯化步骤完成，如无需纯化，则无需进一步制备。但是样品需要稀释来确保其浓度保持在标准曲线的线性误差范围内（20%-80%B/Bo）

 

标准品和样品的准备----乙酰化

标准曲线的准备

用1mlEIA缓冲液重组标准cGMP，吸取100μl标准A到9.9ml的EIA中，此标准品的浓度是3pmol/ml

注意 如果样品利用组织萃取法提取TCA，且不能用至少1:5的EIA来分析，利用乙醚萃取法提取TCA来准备标准曲线。任何稀释的样品需要按此方法进行

用EIA准备标准曲线： 取9个干净试管依次编号#0至#8，吸取900μl到#0（只含有buffer），#2至#8加入500μlEIAbuffer，吸取1ml标准B（3pmol/ml）到#1 ，然后吸取500μl到#2中稀释，混匀后，从#2中吸取500μl到#3中，混匀，以此类推，至#8，稀释液保存不能超过24小时

样品准备

如果样品需要纯化，则在乙酰化之前进行纯化（操作参照12-14的纯化操作），虽然纯化不是必需的，但我们建议将样品纯化以确保试验的完整性。如果乙酰化的样品少于500μl，必须加入一定体积的KOH，和适量的无水醋酸。

 

KOH准备

配置4M的KOH溶液，溶解100dtnKOH到10ml的超纯水或者500dtn到50ml的超纯水中

乙酰化步骤（建立在500μl体系中）

#0-#8中所有的标准样品必须乙酰化，每一个样品/标准品都必须单独的乙酰化。确保在同一条件下进行乙酰化是很重要的，混合时间的不同或者是加入KOH的时间有误都会影响试验结果。

500μl的样品，快速加100μl 4M KOH和25μl的无水醋酸，混匀器中混匀15s，加入25μl 4M KOH并混匀，对其余样品重复相同的操作。

注意 如果样品含糖量>250mM，则应该增加合适的KOH和无水醋酸的体积，以确保乙酰化的*反应。

 

一般注意事项

检测前样品禁用有机溶剂进行预处理

样品采集后需立即检测,但在-80℃冻存的样品需解冻,不可立即检测.

建议布板如下:

 （可根据实验的实际情况调整布局）

注释:每块板条都含用2个空白对照孔（Blk）,2个非特异性孔（NSB）,2个zui大值孔（B₀）. 8个标准品孔（双份）,如下图所示:

1.EIA缓冲液

加100 µl EIA缓冲液到非特异性包被孔中（NSB）,加50 µl到zui大值孔中（B₀）.如果加入培养基样品是为了稀释标准曲线的,在非特异性包被孔（NSB）中和zui大值孔（B₀）加50µl培养基样品,另加50 µl EIA缓冲液至NSB孔中.

2.标准品

加试管#8的50µl标准品至S8孔中.再加试管#7的50µl标准品至S7孔中.依次加入各标准品入相应的孔中.

3.样品

依次加50µl样品于相应各孔中,每个样品至少有两个稀释比例.每个稀释比例都做平行样

4.酶联物

加50µl酶联物于相应各孔中（TA孔和Blk孔除外）

5.cGMP抗血清

加50µl抗血清于相应各孔中（TA孔和NBS孔,Blk孔除外）

 

用塑料薄膜（编号:400012）盖板在室温下孵育18h（或在4℃下孵育18h，可些许增加试验灵敏度）

1.临使用前复溶Ellman’s试剂（20ml的试剂足够加100个试验孔）。1支100dtn的Ellman’s试剂（Cat.400050）用20ml的超纯水复溶。注意：复溶Ellman’s试剂不稳定，只能即配即用且避光储存。

2.弃去反应孔中的反应液，用洗液洗5次。

3.每个反应孔加配制的Ellman’s试剂200ul.

4.加5ul示踪试剂至TA孔内。

5.用塑料胶片盖板，在振荡器上振荡反应60-90分钟，若在4℃，则时间约为90-120分钟。

1用干净的纸巾擦去板条底部的指纹.

2移去塑料薄膜,但避免Ellman试剂溅射

3在405-420nm处读数.建议当B₀孔的读数在0.3-1.0  AU（减去空白孔后的值）范围时才读取样本值.如果各孔的值超过1.5则应洗板,加入Ellman试剂再孵育

重测.

结果计算

1.      NSB孔的OD均值

2.      B0孔的OD均值

3.      B0均值减去NSB均值，这就是校正的B0或是校正的zui大结合量

4.      计算剩下微孔的%B/B0（%样品或标准品结合量/zui大结合量）值，S1的吸收值减去NSB的吸收均值，然后除以校正B0值，乘以100即得到了%B/B0，

按此法重复计算剩余的标准品和样品。

标准曲线的绘制

以标准品的%B/B0值为Y轴和cGMP的浓度为X轴绘制曲线，将数据代入到四参数方程式

计算每一个样品的%B/B0值，根据标准曲线的方程式来计算样品的浓度。样品%B/B0值大于80%或小于20%则视为超出了标准曲线的线性范围，需重做，同一样品的不同稀释比例得到的结果相差甚大，则表明有感染，需纯化。