抑制素B（INH—B）ELISA Kit酶免试验说明书

美国进口原装RayBiotech（Cat:EIA-INB-1）

简介

    抑制素B属于TGF-β超家族，家族成员包括抑制素A，TGF-B，活化素，骨成型蛋白，其中抑制素与活化素相关性zui为密切。

    活化素和抑制素都是二聚体蛋白复合结构，每个复合物都是由两个单元结构经二硫键连接组成的。此外，两个复合物都来自同一家族的相关基因和蛋白质，但不同在他们的亚基组成，抑制素是由两个不同的亚单位（a单元与b单元）经二硫键连接形成

抑制素B是由一个alpha单元和一个betaB单元组成

抑制素A是由一个alpha单元和一个betaA单元组成

活化素有同构二聚体和异构二聚体，活化素A（2个betaA单元），活化素B（2个betaB单元），或者是活化素AB（1个betaA和一个betaB单元）

抑制素在生殖调节方面有着重要的作用。抑制素和活化素在作为生殖轴的调节器时通常发挥相反的作用，而在生殖生理学调节方面可发挥多种作用。zui近报道称抑制素在肿瘤方面已有新发现。抑制素在多个细胞组织内被报道为潜在的肿瘤基因，包括前列腺，卵巢，子宫内膜和乳房，抑制素的低表达或低灵敏度都与肿瘤的起始和恶化相关联

实验原理

抑制素B酶免试剂盒用于抑制素B肽的定量检测，依据的是竞争酶免法

包被板内预包被了抗兔二抗， 抗抑制素B抗体经封闭、孵育后，生物素标记的抑制素B肽和标准品或样品中的目的肽会竞争结合抑制素B抗体，结合的生物素B肽与辣根过氧化物酶连接，会发生颜色改变。颜色强度与复合物的量成正比，而与标准品或样品中的抑制素B的量成反比。这是由于生物素标记的抑制素B肽和标准品或样品竞争结合抑制素B抗体。样品浓度可从标准曲线上读取

试剂盒组成

1.       包被板 96T，包被有二抗

2.       洗涤缓冲浓缩液（20X） 25mL

3.       标准品 2支，10µl/支

4.       抗抑制素B单抗 2支，5µl/支

5.       试验稀释液A  30mL，含0.09%的叠氮化物作为防腐剂，用于标准品和血清或血浆样品的稀释

6.       试验稀释液B  15mL，5X的浓缩缓冲液，用于稀释标准品和上清液或其他样品

7.       生物素标记物  2支，20µl/支

8.       辣根过氧化物酶浓缩液  8µl，20000X酶连液

9.       阳性质控 1支，100µl

10.   TMB显色液  12mL

11.   终止液  8mL，2M的硫酸

12.   坐标纸

13.   说明书

储存条件

标准品，生物素标记物和阳性质控应保存在-20℃或者-80℃（建议-80℃），避免反复冻融

其他试剂保存在-20℃

开封的包被板和抗体在2-8℃下可保存1个月以上，不用的包被板应重新装入干燥的密封袋内

实验所需材料（但试剂盒未提供的）

所需材料省略！

试剂准备

如果检测的是血清或血浆，则用试验稀释液A稀释生物素标记物和标准品，如果检测的是上清或其他样品，则用试验稀释液B稀释。

1.       试剂准备阶段都要在冰浴上进行，打开密封袋之前包被板要平衡至室温

2.       试验稀释液B需用去离子水稀释5倍

3.       抗抑制素B抗体使用前应离心，然后加入50µl 1X的试验稀释液B，移液枪吹打混匀，得到抗体浓缩液。

4.       抗体浓缩液再用1X的试验稀释液B稀释100倍，这就是抗抑制素B抗体工作液。

5.       生物素标记物使用前离心，然后吸取5µl与5mL的试验稀释液混合，zui终得到100pg/ml的生物素标记物

6.       标准品的准备：一次标记6个试管，浓度依次为10000pg/ml，1000pg/ml，100pg/ml，10pg/ml，1pg/ml和0pg/ml。除了10000pg/ml的试管外，其余每管加入450µl生物素标记物。确保所有标准品中生物素标记物的浓度是100 pg/ml很重要。

抑制素B先离心，然后吸取8µl抑制素B和792µl的100pg/ml生物素标记物混合，这就得到了抑制素Bstock溶液,混匀，作为1号标准品，标记10000pg/ml，接下来可按如下图进行稀释

7.       生物素标记物进行10倍稀释，2µl的生物素标记物和18µl的试验稀释液混合。

8.       阳性质控：离心，在阳性质控管内加101µl的试验稀释液B，然后再加入4µl 10倍稀释了的生物素标记物，这就是2倍稀释的阳性质控。

9.       如果洗涤浓缩液含有可见沉淀物，将其平衡至室温，摇晃直至溶解。20mL的洗涤浓缩液用蒸馏水稀释至400mL 1X的洗涤缓冲液

10.   样品：血清血浆样品用试验稀释液A和生物素标记物稀释，而上清液和其他样品则用1X的试验稀释液B和生物素标记物稀释。确保样品中生物素标记物的zui终浓度为100 pg/ml很重要

11.   过氧化物酶使用前应进行离心，用1X的试验稀释液B进行20000倍的稀释

实验步骤

1.       试剂准备阶段应在冰浴上进行，所有标准品和样品都应做一平行样

2.       每孔内加入100µl抗抑制素B抗体，室温下振荡孵育1.5小时，也可在4℃下孵育过夜

3.       弃去液体，用1X的洗涤缓冲液（200-300µl）洗涤4次，吸水纸上拍干

4.       标准品，阳性质控和样品各100µl加入相应的孔内，盖板，室温下振荡孵育2.5小时，或是4℃过夜

5.       弃去液体，洗板4次

6.       每孔加入100µl的过氧化物酶溶液，室温下孵育45min，孵育时间要把握好

7.       弃去液体，洗板4次

8.       每孔加入100µl的TMB底物液，暗处室温下振荡孵育30min

9.       每孔加入50µl的终止液，立即用酶标仪读数

结果计算

计算各标准品，质控品和样品的OD均值，减去空白组OD值。以标准品浓度为X轴，吸光率为Y轴，坐标纸上画标准曲线。

吸收率=（B-OD_空白）/（B₀-OD_空白）

B=样品和标准品的OD值

B₀=零标准品的OD值

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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